Häiretegurid PCR -reaktsioonides

PCR -reaktsiooni ajal ilmnevad sageli mõned segavad tegurid.
PCR -i väga kõrge tundlikkuse tõttu peetakse saastumist üheks olulisemaks teguriks, mis mõjutab PCR -i tulemusi ja võib anda valepositiivseid tulemusi.
Sama kriitilised on erinevad allikad, mis põhjustavad valenegatiivseid tulemusi. Kui PCR -segu üks või mitu olulist osa või amplifikatsioonireaktsioon ise on pärsitud või segatud, saab diagnostilist testi takistada. See võib põhjustada tõhusust ja isegi valenegatiivseid tulemusi.
Lisaks pärssimisele võib enne proovi ettevalmistamist saatmise ja/või ladustamise tingimuste tõttu tekkida sihtmärginukleihappe terviklikkuse kaotamine. Eelkõige võivad kõrged temperatuurid või ebapiisav säilitamine põhjustada rakkude ja nukleiinhapete kahjustusi. Rakkude ja kudede fikseerimine ning parafiini kinnistamine on DNA fragmenteerimise ja püsiva probleemi põhjused (vt joonised 1 ja 2). Nendel juhtudel ei aita isegi optimaalne eraldamine ja puhastamine.

Joonis 1 | Immobiliseerimise mõju DNA terviklikkusele
Agaroosgeeli elektroforeesis näitas, et lahkamiste parafiini lõikudest eraldatud DNA kvaliteet varieerus märkimisväärselt. Erineva keskmise fragmendi pikkusega DNA oli väljavõtetes sõltuvalt fikseerimismeetodist. DNA säilitati ainult siis, kui fikseeriti natiivsetes külmutatud proovides ja puhverdatud neutraalse formaliiniga. Tugevalt happelise bouiini fikseeritava või puhastamata, sipelghapet sisaldava formaliini kasutamine põhjustas olulise DNA kadu. Ülejäänud osa on väga killustatud.
Vasakul ekspresseeritakse fragmentide pikkus kilobaasipaarides (KBP)

Joonis 2 | Nukleiinhappe sihtmärkide terviklikkuse kaotamine
(A) 3′-5 'vahe mõlemal ahelal põhjustab sihtpunkti DNA purunemise. DNA süntees toimub endiselt väikesel fragmendil. Kui DNA fragmendil puudub praimeri lõõmutamiskoht, tekib ainult lineaarne võimendus. Kõige soodsamal juhul võivad fragmendid üksteist taastuda, kuid saagikus on väike ja madalam.
(B) Aluse kaotus, peamiselt depurinatsiooni ja tümidiini dimeeri moodustumise tõttu, põhjustab H-sidemete arvu vähenemist ja TM-i langust. Pirn soojenemisfaasis sulavad praimerid maatriksi DNA -st eemale ega anna isegi vähem rangetel tingimustel.
c) külgnevad tümiini alused moodustavad TT -dimeeri.
Teine levinud probleem, mis ilmneb sageli molekulaardiagnostikas, on sihtnukleiinhapete vähem optimaalne vabanemine võrreldes fenool-kloroformi ekstraheerimisega. Äärmuslikel juhtudel võib seda seostada valenegatiividega. Palju aega saab säästa rakujääkide keetmise lüüsi või ensümaatilise seedimisega, kuid selle meetodi põhjustab sageli madalat PCR -tundlikkust, kuna nukleiinhappe ebapiisav vabanemine.

Polümeraasi aktiivsuse pärssimine amplifikatsiooni ajal

Üldiselt kasutatakse inhibeerimist konteineri kontseptsioonina, et kirjeldada kõiki tegureid, mis viivad PCR -i suboptimaalsete tulemusteni. Rangelt biokeemilises mõttes piirdub inhibeerimine ensüümi aktiivsusega, st vähendab või hoiab ära substraadi-toote muundamise interaktsiooni kaudu DNA polümeraasi või selle kofaktori aktiivse saidiga (nt Mg2+ TAQ DNA polümeraasi jaoks).
Proovi komponendid või mitmesugused puhvrid ja reaktiivid sisaldavad ekstraktid võivad ensüümi otseselt pärssida või kofaktorid (nt EDTA) lõksu püüda, inaktiveerides sellega polümeraasi ja põhjustades omakorda vähenenud või valenegatiivse PCR tulemusteni.
Kuid paljusid reaktsiooni komponentide ja sihtmärki sisaldavate nukleiinhapete vahelist koostoimet nimetatakse ka PCR inhibiitoriteks. Kui raku terviklikkus on isoleerimine häiritud ja nukleiinhape vabaneb, võib tekkida proovi ja selle ümbritseva lahuse ja tahke faasi interaktsioonid. Näiteks võivad „koristajad” siduda ühe- või kaheahelaliste DNA-d mittekovalentsete interaktsioonide kaudu ning häirida eraldamist ja puhastamist, vähendades sihtmärkide arvu, mis lõpuks jõuavad PCR-reaktsiooni anumani.
Üldiselt leidub PCR inhibiitoreid enamikus kehavedelikes ja kliiniliste diagnostiliste testide jaoks kasutatavate reagentide korral (uriinis, hemoglobiin ja verevaliriini karbamiid), toidulisandites (orgaanilised komponendid, glükogeen, rasv, Ca2+ ioonid) ja keskkonnas (fenoolid, rask metallid) (rask metallid) (fenolid) (fenolid), rask metallid (fenolid) (fenolid) (fenolid), toidulisandid (glükogeen, rasv, ca2+ ioonid), toidulisandid), toidulisandid ja komponendid), rask

Veel levinud PCR inhibiitoreid võib leida bakteritest ja eukarüootsetest rakkudest, mitte-sihtmärgi DNA-st, koemaatriksite DNA-d siduvatest makromolekulidest ja laboratoorsetest seadmetest, näiteks kindadest ja plastidest. PCR inhibiitorite eemaldamiseks eelistatud meetod on nukleiinhapete puhastamine.
Tänapäeval võivad mitmesugused automatiseeritud ekstraheerimisseadmed asendada paljusid käsitsi protokolle, kuid 100% -list taastumist ja/või sihtmärkide puhastamist pole kunagi saavutatud. Puhastatud nukleiinhapetes võivad endiselt esineda potentsiaalseid inhibiitoreid või need võivad juba jõustuda. Inhibiitorite mõju vähendamiseks on erinevad strateegiad. Sobiva polümeraasi valimisel võib olla märkimisväärne mõju inhibiitori aktiivsusele. Muud tõestatud meetodid PCR -i inhibeerimise vähendamiseks on polümeraasi kontsentratsiooni suurendamine või lisaainete, näiteks BSA rakendamine.
PCR -reaktsioonide pärssimist saab näidata sisemise protsessi kvaliteedikontrolli (IPC) abil.
Kõigi reaktiivide ja muude lahuste eemaldamiseks, näiteks etanool, EDTA, CETAB, LICL, GUSCN, SDS, isopropanool ja fenool, tuleb eemaldada nukleiinhappe isolaadist põhjaliku pesemise etapi abil. Sõltuvalt nende kontsentratsioonist võivad nad PCR -i aktiveerida või pärssida.