Häirivad tegurid PCR reaktsioonides

PCR-reaktsiooni ajal puutuvad sageli kokku mõned segavad tegurid.
PCR-i väga kõrge tundlikkuse tõttu peetakse saastumist üheks kõige olulisemaks PCR-i tulemusi mõjutavaks teguriks ja see võib anda valepositiivseid tulemusi.
Sama kriitilised on erinevad allikad, mis viivad valenegatiivsete tulemusteni. Kui PCR-i segu üks või mitu olulist osa või amplifikatsioonireaktsioon ise on inhibeeritud või häiritud, võib diagnostiline test olla takistatud. See võib viia efektiivsuse vähenemiseni ja isegi valenegatiivsete tulemusteni.
Lisaks inhibeerimisele võib proovi ettevalmistamisele eelnevate transpordi- ja/või säilitamistingimuste tõttu tekkida sihtnukleiinhappe terviklikkuse kadu. Eelkõige võivad kõrged temperatuurid või ebapiisav säilitamine põhjustada rakkude ja nukleiinhapete kahjustamist. Rakkude ja kudede fikseerimine ning parafiini kinnitumine on hästi tuntud DNA fragmenteerumise põhjused ja püsiv probleem (vt joonised 1 ja 2). Sellistel juhtudel ei aita isegi optimaalne isoleerimine ja puhastamine.

Joonis 1 | Immobiliseerimise mõju DNA terviklikkusele
Agaroosgeelelektroforees näitas, et lahkamiste parafiinilõikudest eraldatud DNA kvaliteet varieerus märkimisväärselt. Sõltuvalt fikseerimismeetodist esines ekstraktides erineva keskmise fragmendi pikkusega DNA. DNA säilis ainult siis, kui see fikseeriti natiivsetes külmutatud proovides ja puhverdatud neutraalses formaliinis. Tugevalt happelise Bouini fiksaatori või puhverdamata sipelghapet sisaldava formaliini kasutamine põhjustas olulise DNA kadu. Ülejäänud fraktsioon on väga killustatud.
Vasakul on fragmentide pikkus väljendatud kilobaasipaarides (kbp)

Joonis 2 | Nukleiinhappe sihtmärkide terviklikkuse kaotus
(a) 3'-5' vahe mõlemal ahelal põhjustab siht-DNA katkemise. DNA süntees toimub siiski väikesel fragmendil. Kui aga DNA fragmendil puudub praimeri anniilimiskoht, toimub ainult lineaarne amplifikatsioon. Kõige soodsamal juhul võivad fragmendid üksteist uuesti küllastada, kuid saagised on väikesed ja alla tuvastamistaseme.
(b) Aluste kadu, peamiselt depurinatsiooni ja tümidiini dimeeri moodustumise tõttu, põhjustab H-sidemete arvu vähenemist ja Tm vähenemist. Pikendatud soojenemisfaasi ajal sulavad praimerid maatriks-DNA-st eemale ja ei anniildu isegi vähem rangetes tingimustes.
(c) külgnevad tümiinalused moodustavad TT dimeeri.
Teine levinud probleem, mis molekulaardiagnostikas sageli esineb, on sihtnukleiinhapete vähem kui optimaalne vabanemine võrreldes fenool-kloroformi ekstraheerimisega. Äärmuslikel juhtudel võib seda seostada valenegatiivsete tulemustega. Palju aega saab säästa rakujääkide keeva lüüsi või ensümaatilise seedimisega, kuid selle meetodi tulemuseks on sageli madal PCR tundlikkus nukleiinhapete ebapiisava vabanemise tõttu.

Polümeraasi aktiivsuse pärssimine amplifikatsiooni ajal

Üldiselt kasutatakse inhibeerimist konteinerkontseptsioonina, et kirjeldada kõiki tegureid, mis viivad suboptimaalsete PCR-tulemusteni. Rangelt biokeemilises mõttes on inhibeerimine piiratud ensüümi aktiivsusega, st see vähendab või takistab substraadi-produkti konversiooni interaktsiooni kaudu DNA polümeraasi või selle kofaktori aktiivse saidiga (nt Mg2+ Taq DNA polümeraasi puhul).
Proovis olevad komponendid või mitmesugused reagente sisaldavad puhvrid ja ekstraktid võivad ensüümi otseselt inhibeerida või selle kofaktoreid (nt EDTA) kinni püüda, inaktiveerides seeläbi polümeraasi ja põhjustades omakorda PCR tulemuste vähenemist või valenegatiivseid tulemusi.
Kuid paljusid koostoimeid reaktsioonikomponentide ja sihtmärki sisaldavate nukleiinhapete vahel nimetatakse ka "PCR-i inhibiitoriteks". Kui raku terviklikkus on eraldamisega rikutud ja nukleiinhape vabaneb, võivad proovi ja seda ümbritseva lahuse ja tahke faasi vahel tekkida interaktsioonid. Näiteks võivad "püüdurid" siduda ühe- või kaheahelalist DNA-d mittekovalentsete interaktsioonide kaudu ning häirida eraldamist ja puhastamist, vähendades lõpuks PCR reaktsioonianumasse jõudvate sihtmärkide arvu.
Üldiselt on PCR inhibiitorid enamikus kehavedelikes ja kliinilistes diagnostilistes testides kasutatavates reagentides (uurea uriinis, hemoglobiin ja hepariin veres), toidulisandites (orgaanilised komponendid, glükogeen, rasv, Ca2+ ioonid) ja keskkonnakomponentides (fenoolid). , raskmetallid)

Levinumaid PCR-i inhibiitoreid võib leida bakterites ja eukarüootsetes rakkudes, mittesiht-DNA-s, koemaatriksite DNA-d siduvates makromolekulides ja laboriseadmetes, nagu kindad ja plastid. Nukleiinhapete puhastamine ekstraheerimise ajal või pärast seda on eelistatud meetod PCR inhibiitorite eemaldamiseks.
Tänapäeval võivad mitmesugused automatiseeritud ekstraheerimisseadmed asendada paljusid manuaalseid protokolle, kuid 100% taastamist ja/või sihtmärkide puhastamist pole kunagi saavutatud. Potentsiaalsed inhibiitorid võivad puhastatud nukleiinhapetes endiselt esineda või olla juba jõustunud. Inhibiitorite mõju vähendamiseks on erinevaid strateegiaid. Sobiva polümeraasi valikul võib olla oluline mõju inhibiitori aktiivsusele. Teised tõestatud meetodid PCR inhibeerimise vähendamiseks on polümeraasi kontsentratsiooni suurendamine või lisandite (nt BSA) kasutamine.
PCR-reaktsioonide inhibeerimist saab näidata sisemise protsessi kvaliteedikontrolli (IPC) kasutamisega.
Tuleb hoolitseda selle eest, et kõik reaktiivid ja muud ekstraheerimiskomplektis olevad lahused, nagu etanool, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanool ja fenool, eemaldataks nukleiinhappeisolaadist põhjaliku pesemisetapiga. Sõltuvalt nende kontsentratsioonist võivad nad aktiveerida või pärssida PCR-i.